结合文献，讨论细胞膜蛋白与细胞质蛋白的分离与分析方法

在基础医学和生命科学研究中，我们经常需要对细胞中位于不同区块的蛋白质进行分离。膜蛋白包括可溶的膜蛋白和整合膜蛋白，在胞间连接、信号传导、物质交换与运输等过程中都起到重要作用。除此以外，膜蛋白从其无功能、位于细胞质的前体形式，向细胞膜表面转运的过程，也是研究其功能过程中的重要着眼点。因此，区分膜蛋白（包括细胞表面蛋白和其他生物膜上的结合/游离膜蛋白）和细胞质蛋白，对于相关研究来说是十分重要的。这里我们结合一篇文献，来对这一技术要点进行解释和分析。

文章名称是：
A non-pump function of sodium iodide symporter in thyroid cancer via crosstalk with PTEN signaling.
F. Feng, L. Yehia, C. Eng et al. Cancer Res, 2018, 78(21): 6121-6133. (IF=9.1)
作者第一单位是美国克利夫兰医学中心。


——钠-碘转运蛋白（NIS）是经典的碘离子泵，在甲状腺细胞中NIS通常位于细胞质膜上，而NIS的表达水平据信与甲状腺癌的主流治疗方案——放射性碘疗法的成功相关。虽然甲状腺癌组织中，放射性碘的摄取能力通常发生了减退；但据报道，胞内非膜NIS的水平有所提高，这表示NIS起到了与离子泵无关的功能。甲状腺癌是Cowden综合征的主要组成癌种之一，后者中有一部分是由PTEN基因（PIP3磷酸酶编码基因）的遗传突变所引起的。
——本研究中，作者研究了甲状腺癌细胞中NIS的非经典性致癌作用，这一作用与PTEN信号通路相关。在甲状腺癌细胞系中敲低了PTEN表达后，NIS-LARG（白血病相关RhoA鸟嘌呤交换因子）的互作水平提高，从而使胞内NIS蛋白更加稳定。细胞质中NIS水平的提高进一步促进了RhoA的活化，并引起了细胞表型更加倾向于细胞迁移和致癌。通过PI3K/AKT/mTOR信号通路的活化而抑制NIS的糖基化，这使得NIS在细胞质中出现定位错误，使其通过与LARG（主要位于细胞质内）的互作而起到非离子泵的致癌作用。此外，PTEN或PI3K/AKT/mTOR信号通路还可以影响DPAGT1（与N连接糖基化过程起始步骤相关的糖基化酶），从而抑制NIS的糖基化过程。
——总的来说，本文的结果表示甲状腺癌细胞中NIS存在一种与离子泵功能无关的致癌作用，这种作用是通过NIS与PTEN信号通路的互作实现的。

而文章中使用的实验技术，除了常规的细胞培养和迁移实验、RNA提取与定量PCR、蛋白质（全细胞组分）提取、定量（BCA法）、SDS-PAGE-WB测定、免疫荧光和分子生物学操作（转染、敲低）实验外，我们要着重介绍的就是该文章中对细胞表面和细胞质中NIS的定量测定。

由于文章的重点就在于如何区别细胞表面（细胞质膜表面）和细胞质内的NIS蛋白，作者使用了两种特制试剂盒以分离细胞表面蛋白和细胞质内蛋白，将其分别提取并进行半定量分析（WB法）来特异性地分析不同形式的NIS蛋白的表达水平。其中细胞表面蛋白分离纯化所使用的是Pierce Cell Surface Protein Isolation Kit (ThermoFisher)，而细胞质蛋白组分分离纯化所使用的是Mem-PER Plus Membrane Protein Extraction Kit (ThermoFisher)。

其中前一个试剂盒分离的就是附着于细胞质膜上（也就是细胞表面）的蛋白质，而后一个试剂盒可以做到将细胞蛋白分为膜蛋白和细胞质（可溶）蛋白两个组分。这里的区别在于，后者所分离得到的膜蛋白包括细胞质内部有膜结构细胞器上的膜蛋白，同时可以将细胞质的蛋白质单独提取出来。下面我们将简要介绍这两种试剂盒的基本原理和操作方法：

——Thermo Scientific Pierce Cell Surface Protein Isolation Kit，用于分离细胞表面蛋白

基本原理：使用特殊的生物素标记试剂，对哺乳动物细胞表面的蛋白质进行标记，随后使用温和的表面活性剂对细胞进行裂解，然后通过带有亲和素的琼脂糖凝胶捕获此前标记生物素的细胞表面蛋白，此时未被标记的胞内蛋白组分经过多次清洗后被分离。使用SDS-PAGE上样缓冲液（含DTT），可以从含有表面蛋白的凝胶中洗脱目的蛋白，这样得到的蛋白质样品可以直接用于SDS-PAGE实验，以及后续的WB实验。


简要步骤：

1. 将贴壁培养的细胞（一次可使用4瓶细胞，对应细胞数不超过4x10⁷个）清洗干净后，添加生物素标记液进行标记；
2. 标记结束后加入中止缓冲液，然后收集细胞，离心沉淀并洗净细胞；
3. 加入裂解缓冲液，在裂解细胞过程中不时使用超声处理；
4. 将细胞裂解液加入已经制备好的亲和素琼脂糖凝胶中孵育，使亲和素与生物素标记结合；
5. 离心，并弃掉未结合的杂蛋白；
6. 洗净含有亲和素-生物素标记-目的蛋白的琼脂糖凝胶；
7. 制备含有DTT的SDS-PAGE上样缓冲液，并加入凝胶中孵育洗脱；
8. 离心收集洗脱下来的目的表面蛋白，加入溴酚蓝备存。

——Mem-PER Plus Membrane Protein Extraction Kit，用于分离生物膜蛋白和细胞质中的蛋白

基本原理：使用基于表面活性剂的提取方法，从哺乳动物细胞或组织中富集膜蛋白，首先使用温和表面活性剂对细胞进行增透处理，以释放可溶的细胞质/胞浆蛋白，然后用活性更强的表面活性剂溶解膜蛋白。因此其提取效率随整合膜蛋白跨膜次数而有所变化，一般跨膜结构域1-2个的膜蛋白可以达到90%的提取效率。由于不采用疏水性相分离的提取方法，本试剂盒可以得到更好的重现性和更高的产量。此外，所得到的胞浆蛋白样本和膜蛋白样本都可以直接用于BCA定量分析和SDS-PAGE实验（及后续的WB实验）。


简要步骤：

1. 将贴壁培养的细胞或悬浮培养的细胞（细胞数建议为5x10⁶个）清洗干净；

——也可以使用哺乳动物的软组织和硬组织，建议使用量为20-40mg，需要首先进行剪碎、研磨、清洗和过滤；

1. 加入细胞增透缓冲液（即上面所说的温和表面活性剂），孵育使胞浆蛋白渗出细胞；
2. 离心，将含有胞浆蛋白的上清液收集备用；
3. 加入增溶缓冲液（即强力表面活性剂），孵育使试剂将膜蛋白从膜上溶解下来；
4. 离心，收集含有膜蛋白的上清液备用。

使用两种试剂盒对膜蛋白和胞质蛋白进行分离后，作者成功的区分了不同位置处，糖基化水平不同的NIS表达水平，并发现了PTEN敲低对各种形式NIS的表达所造成的显著性差异。


通过联合PI3K/AKT/mTOR通路抑制剂的验证实验，作者最终提出了PTEN-PI3K/AKT/mTOR通路与NIS糖基化和运输过程相关的假说，并认为这一调控机制可以为甲状腺癌患者放射性碘治疗效率的改善起到指导意义。

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